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Efeito do Ultra-Som Pulsado de Baixa Intensidade na Manutenção de Massa Óssea Pós-Ovariectomia em Modelo Animal

Efeito do Ultra-Som Pulsado de Baixa Intensidade na Manutenção de Massa Óssea Pós-Ovariectomia em Modelo Animal

A integridade mecânica do osso é preservada pela remodelagem, que consiste em um processo contínuo que alterna a reabsorção óssea proporcionada pelos osteoclastos com a formação devido à ação dos osteoblastos. Essas respostas são regidas por um mecanismo, chamado mecanostato, que adequa a massa e a resistência ósseas à requisição mecânica do osso. Por exemplo, a formação óssea acontece em resposta às tensões mecânicas e é dependente do número e da freqüência das deformações aplicadas.

A perda da massa óssea levando à osteoporose é um processo quase inevitável do envelhecimento. A osteoporose pós-menopáusica foi reconhecida através de estudos epidemiológicos como o maior problema de saúde pública da atualidade. A prevenção das fraturas osteoporóticas é um dos fatores mais importantes na manutenção da qualidade de vida. Para Lorrain apenas metade das vítimas de fraturas osteoporóticas volta a ter total autonomia. Além dessa visão, a intervenção preventiva também é muito importante no ponto de vista sócio-econômico. No Canadá, estima-se que sejam gastos $1.3 bilhões por ano para tratamento de acometimentos resultantes da osteoporose. Projeta-se que as fraturas osteoporóticas no Brasil alcancem 600.000 por ano, sendo 400.000 vertebrais e 200.000 femorais. Estima-se que o número de fraturas de quadril na população mundial cresça de 1.26 milhões em 1990 para 2.6 milhões em 2025 e para 4.5 milhões em 2050. Para Chang a intervenção precoce na osteoporose, tanto em mulheres quanto em homens, é a chave para se atingir o melhor custo-benefício.

O profissional fisioterapeuta possui várias ferramentas de trabalho para alcançar o objetivo de intervenção precoce da osteoporose. Dentre as ferramentas mais importantes encontra-se o exercício físico, a estimulação elétrica, o laser e o ultra-som. Essas ferramentas também são importantes no tratamento do quadro osteoporótico instalado. Muitos pacientes não toleram bem o tratamento medicamentoso e então tratamentos alternativos e não invasivos, como o ultra-som pulsado de baixa intensidade, são uma boa escolha para o controle da perda de massa óssea.

O ultra-som é uma onda mecânica longitudinal, não audível, com freqüência acima de 20 kHz , e é pela sua natureza mecânica que o ultra-som apresenta efeitos sobre a perda de massa óssea. Esses efeitos são baseados em princípios biomecânicos, postulados por WOLLF em 1870, que nos dizem que a carga mecânica promove deformação no osso e conseqüentemente gera um estímulo para uma resposta óssea local. O ultra-som por sua vez, também fornece estímulos mecânicos para o osso, com a vantagem de ser em freqüências muito maiores (1,5 MHz) do que aquelas que podem ser alcançadas pelo exercício.

Em estudos in vitro foi encontrado que o ultra-som terapêutico estimula a síntese da matriz óssea protéica quando utilizado em intensidades próximas a de 0,1 W/cm. Este mesmo autor encontrou resultados que fornecem bases para o uso do ultra-som de baixa intensidade in vivo no tratamento de feridas de tecido moles, fraturas e osteoradionecrose. O tratamento da osteoporose também pode ser baseado nestes achados, onde há uma estimulação dos fibroblastos e osteoblastos com um aumento da síntese de proteínas colagenosas e não-colagenosas, responsáveis pela formação óssea. Outro estudo in vitro mais recente sugere que a estimulação por ultra-som aumenta a superfície de expressão das integrinas e causa reorganização da actina além de contribuir na diferenciação osteoblástica e inibir a gênese do osteoclasto.

O modelo de ratas ovariectomizadas para estudo da perda de massa óssea pós-menopausica é bem aceito pela literatura, sendo o modelo preconizado pelo Food and Drug Administration (FDA) para estudos pré-clínicos de drogas para prevenção e intervenção da osteoporose. Os estudos de Kodama , Danielsen e Peng fornecem suporte para o sucesso deste modelo, demonstrando diferenças significativas no que diz respeito à massa óssea entre o grupo submetido à ovariectomia e o grupo intacto.

Segundo a FDA , os parâmetros a serem monitorados nos estudos pré-clínicos de agentes preventivos ou de intervenção da osteoporose incluem entre outros, a análise da arquitetura óssea com a histomorfometria, marcadores sangüíneos e a densitometria óssea.

Warden demonstra o efeito osteogênico do ultra-som pulsado com intensidades menores do que 100mW/cm (SATA – spatial-averaged temporal-average) por meio de evidências acumuladas em outros estudos, mas ainda há uma carência de estudos nesta área para se definir os melhores parâmetros de aplicação.

Tendo por base as carências referidas acima, o presente estudo visa determinar os efeitos osteogênicos do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre o metabolismo ósseo de ratas maduras ovariectomizadas.

MATERIAIS E MÉTODOS

Delineamento Geral

Estudo experimental para verificação da eficiência do ultra-som pulsado de baixa intensidade na diminuição da perda de massa óssea induzida pela ovariectomia. Controlado com grupo placebo e grupo não tratado.

Animais

Foram utilizadas 21 ratas da linhagem Wistar com idade aproximada de 2 meses no início do experimento. Os animais foram divididos igualmente em 4 grupos: controle (OVX), controle pseudo ovariectomia (PSEUDO-OVX), submetido ao tratamento com ultra-som (US) e submetido ao tratamento com ultra-som placebo (SHAM). Todos tiveram livre acesso à água e à comida e ciclo de luz de 12 horas.

Procedimentos

Os procedimentos realizados seguiram as resoluções do COBEA 18 para experimentação animal. Com a idade de 3 meses todos os animais foram submetidos à cirurgia de ovariectomia bilateral. Foi realizada laqueadura seguida da extirpação dos ovários.

O sacrifício deu-se por decapitação. Foi coletada amostra sangüínea para a dosagem de fosfatase alcalina sérica. A amostra foi mantida a 37ºC durante 30 minutos e posteriormente centrifugada por 15 minutos em 3.000 r.p.m. O plasma sobrenadante foi retirado e mantido em freezer até o dia da epectrofotometria.

Protocolo de Ultra-som e Placebo de Ultra-som

O tratamento foi realizado com um aparelho de ultra-som pulsado de baixa intensidade com transdutor de titanato zirconato de chumbo e área de 3.88 cm2. Apresentava como parâmetros: freqüência fundamental de 1,5MHz, potência de 140 mW e intensidade de 40 mW/cm 2 . Cada rata do grupo US foi tratada 6 vezes por semana, durante 12 semanas iniciando no 3º dia pós-ovariectomia. A sessão diária consistiu de 20 minutos de aplicação ultra-sônica na face lateral do joelho direito. As ratas SHAM foram submetidas à mesma manipulação das ratas US, excentuando-se a aplicação da onda ultra-sônica. O aparelho de ultra-som foi aferido semanalmente para garantir a correta dosimetria no tratamento.

Taxa de Ganho Ponderal e de Consumo Alimentar

O peso das ratas foi medido semanalmente em balança eletrônica. Para o cálculo da taxa de ganho ponderal, seguiu-se a seguinte fórmula:

TAXA DE GANHO PONDERAL (%) = [(Peso final x 100) / Peso inicial] – 100

A ração disponibilizada aos grupos foi previamente pesada para que todos os grupo recebessem a mesma quantidade. Antes da reposição de ração dos animais, a ração restante da última alimentação foi retirada e pesada. Com os dados retirados no último mês de experimento foi possível obter uma taxa de consumo alimentar por grupo. Foi utilizado unicamente o último mês por representar um período regular, sem influência dos procedimentos e de adaptação e já com os efeitos da ovariectomia estabelecidos.

Dosagem de Fosfatase Alcalina

A dosagem da fosfatase alcalina foi feita por sistema colorimétrico utilizando-se a metodologia de Bessey-Lowry modificado. Para tal finalidade utilizou-se o kit Fosfatases da Doles Reagentes e Equipamentos para Laboratórios Ltda. As leitura das absorvâncias foram feitas com o Espectrofotômetro Digital UV-VIS Q798U da Quimis â Aparelhos Científicos Ltda.

Análise Estatística

Utilização do GraphPad InStat versão 3.00 para Windows 95/NT, GraphPad Software, San Diego Califórnia USA. Os dados obtidos em cada grupo e em cada parâmetro (MÉDIA ± DP), foram comparados entre si através da aplicação do método ANOVA para análise de variância e aplicação do Teste paramétrico de Tukey-Kramer – Multiple Comparisons, utilizando um coeficiente de variação p<0,05.

RESULTADOS

Taxa de Ganho Ponderal e de Consumo Alimentar

O grupo que obteve a menor taxa de ganho ponderal foi o tratado com ultra-som. As taxas podem ser vistas na Figura 1. Todos os grupos seguiram o mesmo padrão de aumento de peso, apresentando variabilidade semelhante durante o estudo (Fig. 2)

O grupo OVX ingeriu menores quantidades de alimento do que todos os outros grupos (P<0,05). Nos grupos restantes, a taxa de consumo alimentar não apresentou diferença significativa, mas o grupo US apresentou uma tendência a ingerir menos alimento em comparação com o pseudo-OVX e com o SHAM (Fig. 3).

ultra-som-pulsado-baixa-intensidade-1

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Fosfatase Alcalina

A variação das médias dos grupos foi significativamente maior do que o esperado ao acaso quando testados com o método ANOVA, apresentando um P=0,0029. O grupo tratado com ultra-som apresentou diferença significativa em relação aos grupos pseudo-ovx e sham, com um valor P de 0,0049 e 0,0042 respectivamente (Teste t). O grupo ovx apresentou diferença não muito significante com os grupos pseudo-ovx e sham, com o P de 0,0991 e 0,0705 respectivamente. A figura 3 e as tabelas 1 e 2 fornecem todos os dados necessários para melhor compreensão.

ultra-som-pulsado-baixa-intensidade-4

Tabela 1 – Valor das médias, desvios padrão e erros padrão dos grupos experimentais.

GRUPO

MÉDIA

DESVIO PADRÃO

ERRO PADRÃO

OVX 158,90 24,048 9,089
PSEUDO-OVX 140,96 11,229 4,244
US 180,02 27,824 10,516
SHAM 137,05 16,430 6,210

Tabela 2 – Comparação entre grupos com o Teste t não pareado (P<0,05).

GRUPOS COMPARADOS

VALOR P

DIFERENÇA

OVX vs PSEUDO-OVX 0,0991 Pouco significativa
OVX vs US 0,1545 Não significativa
OVX vs SHAM 0,0705 Pouco significativa
PSEUDO-OVX vs US 0,0049 Muito significativa
PSEUDO-OVX vs SHAM 0,6125 Não significativa
US vs SHAM 0,0042 Muito significativa

DISCUSSÃO

O ultra-som parece ter um efeito sobre o peso corporal, sendo que na pesquisa o grupo com menor aumento de peso em relação ao peso inicial foi o US. Como o rato é um animal de pequeno porte, isto pode ser explicado pelo aumento do metabolismo local propiciado pela onda ultra-sônica.

O grupo ovariectomia controle apesar de apresentar a menor taxa de consumo alimentar foi o grupo com maior ganho percentual de peso. É importante então relembrar a teoria de que o organismo ao perceber a ausência (ou diminuição) de hormônios ovarianos (por exemplo, pós-ovariectomia ou menopausa) cria uma forma de “defender” os ossos fragilizados de possíveis fraturas. Uma forma de obter esse objetivo de proteção é o aumento das camadas adiposas que servirão de barreira mecânica contra possíveis injúrias. Para isso, o metabolismo diminui, fazendo com que menores quantidades de nutrientes gerem maiores taxas de ganho ponderal.

O biorritmo dos animais estava em concomitância, pois a taxa de variação semanal de peso (em %) seguiu o mesmo padrão. Entretanto as diferenças em relação as grandezas são visíveis, respeitando as diferenças essenciais entre os grupos. Por exemplo, na 11ª semana da Figura 2 todos os grupos apresentaram uma menor taxa de ganho de peso do que as semanas adjacentes, mas dentro das grandezas esperadas para cada grupo.

A atividade osteoblástica, ou seja, a formação óssea apresentou-se maior no grupo tratado com o ultra-som, como o esperado no início do experimento. O US apresentou uma diferença extremamente significativa quando comparado com o tratamento placebo de ultra-som (P<0,01, P=0,0042), evidenciando que é a onda ultra-sônica a causadora desse aumento na atividade osteoblástica ao invés da manipulação e do estresse gerado durante o tratamento. O grupo US não apresentou diferença significativa com o OVX, pois o grupo OVX provavelmente apresenta o turnover ósseo aumentado significando uma maior ação osteoclástica e conseqüente maior ação osteoblástica, pois estes dois fenômenos estão interligados.

CONCLUSÕES

•  O tratamento com ultra-som pulsado de baixa intensidade aumenta a formação óssea, identificado pela fosfatase alcalina. Novas pesquisas devem ser feitas utilizando marcadores ósseos para verificar a reabsorção, e assim ter uma idéia completa do turnover ósseo durante o tratamento com ultra-som;

•  Tendência a um menor aumento de peso corporal pelo grupo tratado com ultra-som e a uma menor ingestão alimentar pelo grupo ovariectomia controle. Pesquisas posteriores com um rígido controle metabólico se mostram importantes;

•  O peso seco e peso das cinzas são parâmetros importantes e necessitam ser estudados posteriormente.

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